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SEM生物样品制备干燥方法

发布日期:2018年03月23日    浏览次数:1390

作者:肖媛胡锐婷婷崔宗斌


生物样品的含水量一般为 70% ~ 80% , 仅有少数样品如毛发牙齿角质以及含水量极低的昆虫等可以直接喷镀观察,绝大多数的生物样品均要求经过干燥处理才能镀金和进行扫描电镜观察 干燥是扫描电镜生物样品制备中的关键环节,如果处理不好,会直接影响到观察的清晰度与准确度, 甚至直接导致试验失败 要想制备出好的扫描电镜生物样品, 要求在干燥过程中尽可能减少由于水分蒸发而引起的样品表面形貌的变形( 体积变化结构皱缩或干裂等) , 且必须确保干燥彻底 大多数动植物, 特别是柔软的细胞和组织,在干燥时由于体积应力和表面张力的作用,容易发生明显的塌陷和变形 因此, 需要针对不同的生物样品来选择合适的干燥方法, 在样品不受或少受表面张力等因素的影响下,不变地将液体溶剂去掉,达到干燥的目的。

干燥的方法很多, 比如临界点干燥法自然干燥法冷冻干燥法叔丁醇真空干燥法六甲基二硅胺烷干燥法乙腈干燥法烘干干燥法氮气干燥法和微波干燥法等 这些方法各有利弊, 且适用样品种类不同因此,根据生物样品的特性选择一种适宜的干燥方法十分重要

自然干燥法

自然干燥法是指样品中的水分在大气中自然蒸发,或样品经脱水处理后脱水剂自然挥发而干燥的方法样品从含脱水剂状态下进行自然干燥与样品从含水状态下进行自然干燥相比, 由于脱水剂的表面张力系数小于水,所以前者样品变形较小 自然干燥法对于含水量较多的动植物组织游离细胞等的干燥是不适用的, 因为干燥过程中表面张力将使样品变形自然干燥法对干种子果壳某些干花粉长期保存的昆虫针插标本和 70% 乙醇浸泡的昆虫标本以及蛋壳和蛋膜等样品是一个简易实用有效的方法, 虽然在自然干燥过程中,样品体积有所收缩,但却保留了样品的基本形态 

烘干干燥法

此方法将要研究的样品用烘干箱烘干, 一般温度控制在 80℃ 以下,烘干程度以含水量在 5% 以下为好此方法的干燥速度较快, 但水分蒸发时可能造成样品变形或微小断裂适用于不易变形且耐热的样品, 比如淀粉粒孢子粉等 

临界点干燥法

此方法是根据物质处在临界点时的特殊物理状态设计的一种干燥方法在临界状态下, 液体和气体的密度相等,气液界面完全消失,液体的表面张力系数为零临界点干燥法之所以一直被视为制作生物医学扫描样品最可靠的干燥方法, 是因为此法能消除液体表面张力的作用, 干燥出的样品能最大程度地保存其自然形态临界点干燥法适合多种生物样品的干燥

冷冻干燥法

冷冻干燥法是利用低温和真空, 使样品中的水分直接由冰升华,或经过某种升华介质由固相升华,以达到干燥样品的目的 冷冻干燥过程使水分从固态直接转化为气态,不经过液态阶段,因而避免了气相和液相之间表面张力对样品的损伤 根据选用的冷冻介质的不同,冷冻干燥法又可以分为从水中直接冷冻干燥和从有机溶剂中干燥与水相比, 有机溶剂在冰冻后形成非晶体固态,不会产生冰晶损伤样品,且能以最快的速度从固态升华,大为缩短了干燥时间 

真空干燥法

真空干燥法指的是将经脱水的样品置于真空容器中进行干燥的方法真空干燥法选用高熔点的有机材料( 叔丁醇乙腈六甲基二硅胺烷正丁醇等) 作升华介质,既保留了冷冻干燥法的优点,又不用对样品进行冷冻处理, 无冷冻损伤, 且操作简单最常用的真空干燥法是以叔丁醇为升华介质的叔丁醇干燥法, 乙腈干燥法六甲基二硅胺烷干燥法正丁醇干燥法等用的相对较少。


上述 5 种干燥方法各有优缺点,且适合于不同的生物样品种类一般认为目前在用的最好的干燥方法是临界点干燥法; 其次是冷冻干燥法真空干燥法和自然干燥法 虽然干燥方法在不断改进,但还是只能把由干燥引起的样品变形控制在一定的范围内临界点干燥法被认为是一种最理想的干燥方法, 但仍存在大约 5% 的变形 

有研究结果表明,叔丁醇干燥法对有些材料来说可与临界点干燥相媲美,而且前者具有操作简便,叔丁醇可代替酒精做脱水剂, 可同时干燥较大量的样品, 样品不易被污染安全可靠所需仪器常规实验室均有配备等优点 采用叔丁醇干燥法干燥的各种动植物样品各项指标均较理想,与临界点干燥法的效果基本相同,因此认为叔丁醇干燥法也是制作生物医学扫描样品时首选的干燥方法。所以在实际应用中, 应该根据不同的样品和实验目的来选择不同的干燥方法。

微生物植物和动物的 SEM 样品干燥方法

微生物

研究表明对单细胞生物采用叔丁醇干燥法要比自然晾干和烘干脱水更彻底成像更理想 

对于细菌细胞一类微小的样品,采用临界点和冷冻干燥法较难操作, 但若采用固定脱水之后将样品点于盖玻片上再真空干燥的方法,效果还是比较理想的, 而且方便操作 

总之, 对于微生物等微小的生物样品,如果想要操作简便,可以选用自然干燥法或烘干干燥法; 如果想要获得较好的效果,建议选用临界点干燥法或真空干燥法。

植物

一般来说,含水量较少细胞壁和蜡质层较厚的植物组织多采用自然干燥法,而幼嫩含水分较多的组织则需要选择其他方法临界点干燥法和叔丁醇干燥法几乎适用于各类型的植物样品,但是考虑到操作的复杂性,能使用更简便的干燥方法时一般不选用它们

动物

临界点干燥法是动物样品的首选干燥方法考虑到操作的简便性, 对于含水量低且观察部位相对较硬的动物样品也可以采用自然干燥法, 但是含水量高且较柔软的样品推荐采用临界点干燥或叔丁醇真空干燥法

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